細胞在體外進行培養(yǎng),失去了機體的調節(jié)和控制,因此,除滿足營養(yǎng)的要求外,還必須使細胞生存環(huán)境晝接近活體的環(huán)境.外環(huán)境的培養(yǎng)條件如溫度、滲透壓、酸堿度等均能影響細胞的生長.

　　一、溫度：

　　一般哺乳類及禽類細胞體外培養(yǎng)的適宜溫度是37~38℃.溫度過高或過低都會影響到細胞的生長.細胞耐受低溫的能力比抗熱的能力強,在低溫下,細胞的代謝活力及核分裂降低.溫度低于0℃時,雖影響細胞代謝,但并無傷害作用.把細胞置于23~25℃時,細胞仍能生存和生長,但速度減緩,不過,魚類細胞的適宜培養(yǎng)溫度為23~25℃.若溫度過低,在降到冰點以下時,細胞因胞外水和胞質結冰而受損死亡,但若向培養(yǎng)基中加入甘油或二甲基亞砜（DMSO）等保護劑,封入安瓿中后,置于液氮或低溫冰箱（-70℃）中,可起保護作用,此時細胞可而耐受-70℃以下溫度,能長期儲存,解凍后細胞復蘇,仍能繼續(xù)生長增殖,細胞物性狀不受任何影響.此為保存細胞的主要手段.

　　高溫對細胞培養(yǎng)不利.細胞在39~40℃培養(yǎng)1h,會受到一定損傷,但仍有可能恢復,但不能忍受溫度再升高2℃,持續(xù)數小時,即在41~42℃培養(yǎng)1h,細胞操作嚴重,溫度到43℃以上時細胞多數被殺死.高溫主要引起酶的滅活、類脂質破壞、核分裂的破壞,產生凝固酶使細胞發(fā)生凝固,另外使蛋白質變性.因此,體外培養(yǎng)細胞時一定要避免高溫.

　　二、滲透壓：

　　細胞在高滲透溶液中低滲溶液中,可以立即發(fā)生皺縮或腫脹、破裂.所以,滲透壓是體外細胞培養(yǎng)的重要條件之一.哺乳動物和其他動物組織細胞體外孫女培養(yǎng)的滲透壓的維持主要與NaCl有關,但不能忽視其他電解質與滲透壓的關系,滲透壓與單位體積溶劑內溶質的分子數和離子婁成正比.為此,按一定比例控制培養(yǎng)基中離子平衡,維持正常滲透壓是很重要的.這不僅是為了維持細胞張力,而且是為了調節(jié)細胞的代謝.因為細胞外離子輸送和離子濃度改變著其他營養(yǎng)物質的輸送（如氨基酸、糖等）,直接影響細胞基本合成系統(tǒng).

　　理想的滲透壓因細胞的類型及種族而異,人血漿滲透壓為290mmol/L,被視為是體外培養(yǎng)人類細胞的理想滲透壓.哺乳動物細胞的滲透壓一般為290~300mmol/L.人胚肺成纖維細胞為250~325mmol/L,鼠細胞則為310mmol/L左右.在實際應用中,260~320mmol/L的滲透壓可適于大多數細胞.常用培養(yǎng)基的滲透壓值見表2-3.

　　三、氣體環(huán)境和PH值：

　　體外培植細胞需要理想的氣體環(huán)境,氧和二氧化碳石細胞生存必需的條件之一.

　　1、氧：

　　氧參加細胞的三羧酸循環(huán),產生能量以供應給細胞生長、增殖和合成各種所需成分.有些細胞在低氧條件下,可借糖酵解取得能量,單多數細胞低氧時不能生存.氧張力通常維持在略低于大氣狀態(tài),若氧分壓超過大氣中氧的含量可能對有些細胞有害.

　　2、二氧化碳：

　　采用開放式培養(yǎng)時（碟或培養(yǎng)瓶松蓋培養(yǎng)或培養(yǎng)板培養(yǎng)）,一般要把細胞置于95%空氣加5%二氧化碳的混合氣體環(huán)境中.CO2既是細胞的代謝產物,又是細胞生長所必需的成分,并與維持培養(yǎng)基的pH值有關.在密閉瓶中CO2濃度偏低的情況下,細胞容易生長,一般不能低于1%,否則有損細胞.CO2增加將使pH值下降.

　　3、pH值：

　　大多數細胞適于在pH7.2~7.4條件下生長,低于pH6.8或高于pH7.6對細胞有害,甚至退變或死亡各種細胞對pH值的要求不盡相同.一般原代培養(yǎng)細胞對pH值的堿性的耐受比對酸性的耐受差,偏酸的環(huán)境比偏堿的環(huán)境對細胞生長有利.為了維持培養(yǎng)環(huán)境恒定的pH值,多采用在培養(yǎng)基中加入磷酸鹽等緩沖劑的方法.磷酸緩沖劑中的NaHCO3可供給CO2,但CO2易于逸出,故只適用于封閉式培養(yǎng).若開放式培養(yǎng)還是置于含有5%CO2的氣體環(huán)境中為宜.為克服NaHCO3調整的麻煩,也可用羧基哌唪硫磺酸（N-2 –hydroxyethyl piperazine-N’ethanesulfonic acid,Hepes）,它對細胞無毒性,主要作用是防止pH值迅速變動,在開瓶通氣培養(yǎng)或活細胞觀察時能維持較恒定的pH值.

　　四、無毒和無菌：

　　無毒和無菌是體外培養(yǎng)細胞的首要環(huán)境條件.細胞在深入活體內,偶爾有**或有害物質入侵,因體內有強大的**系統(tǒng)和**系統(tǒng),可將其**或**,而不易受損害.但在離體的環(huán)境中,失去了防御系統(tǒng),一旦有害物質入侵或**污染,可導致細胞死亡,前功盡棄.如培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、支持物、培養(yǎng)基、瓶塞上有細胞毒性,在培養(yǎng)過程中可導致細胞死亡因此,在選用這些器皿、材料時要注意,若這些物品**不*,帶菌或操作過程不小心使細胞污染,也會導致細胞死亡.若出現交叉污染,可使實驗室原來的細胞系失去原有特性,應引起足夠的重視.

　　五、輻射線和超聲波：

　　1、可見光

　　可見光的波長是390~780nm.可見光的各種有色光能引起細胞退變,延長核分裂的間期,還可顯著降低細胞的附壁能力.因此,體外培養(yǎng)細胞應避免日光直接照射,*好在黑暗中進行培養(yǎng)或短期存放.

　　2、紫外線

　　弱紫外線下耐受能力強的細胞變化不大,但對敏感的細胞有損害.紫外線強時,就分離的細胞顯示：不能進行*的有絲分裂；在有絲分裂時增加了脫水收縮；在有絲分裂時細胞質的起泡減少.Elrlich腹水癌細胞經紫外線照射后,用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察發(fā)現被照射表面形成水泡,隨后細胞膨脹,損害也漸變嚴重.

　　3、放射線

　　X射線對細胞有明顯損傷.B射線可影響細胞核的分裂.R射線使核分裂數減少并出現不正常的核分裂,可使細胞死亡.

　　4、超聲波

　　在超聲波振動下,細胞很快會破裂,開始是胞質發(fā)生紊亂的流動,原生質膠體結構也有明顯變化,若停止超聲波振動可恢復.細胞致死的原因是由于產生空化作用所致.當超聲波在2.5W/c㎡時,細胞受損,染色體發(fā)生畸變,首先發(fā)生畸變的是核染色體.

　　六、細胞接種密度：

　　在體外培養(yǎng)細胞中,細胞接種數對細胞的生長有影響,適宜的接種密度,可以促使細胞增殖,接種密度太低或太高都不利于細胞的生長增殖.如果培養(yǎng)基與細胞的容積比例大于2000：1,生長物質彌散到細胞外過多,將使細胞內濃度低于*小限度的濃度,此時細胞不能再增殖,培養(yǎng)基的pH值變堿,抑制細胞生長,細胞變圓不能貼壁,甚至引起細胞死亡等.如果接種密度太高,每個細胞周圍培養(yǎng)基的容積降至0.007㎜3以下,由于彌散率降低,細胞內生物質的濃度增加,容易使排出物或其他代謝產物達到飽和,能量來源也很快耗盡,因此也會防礙細胞的增殖.

　　如何選擇適宜的接種濃度要根據細胞的代謝和生長繁殖速度以及工作的需要而確定.一般來說,代謝旺盛、生長速度快的細胞（如腫瘤細胞）,接種濃度宜偏低；而正常組織細胞生長較慢,代謝不夠旺盛,接種濃度可偏高；如果是為了保種或不需急用,接種可偏低些；有時為了便于觀察細胞形態(tài)結構,接種濃度也可適當降低.

　　七、容器轉動速度和懸浮攪動速度：

　　有時為了研究的需要而將培養(yǎng)細胞在容器中進行旋轉或攪動,如貼壁細胞在旋轉管中培養(yǎng),使轉鼓的轉速提高,細胞增殖率隨之提高.其原因可能是轉動使足夠的營養(yǎng)物質流動和較充分的氧化作用之故.

　　當懸浮攪拌培養(yǎng)細胞時,攪拌速度既不能太快,也不能太慢.如果太慢,細胞易結團、下沉和貼壁,不利于細胞在懸浮狀態(tài)下增殖.如果太快,容易起泡沫,細胞易窒息致死,同時,強烈地攪動易使細胞因機械損傷而破裂.所以選擇適宜的攪拌速度很重要.如BHK-21細胞的攪拌適宜速度為460～330r/min；**細胞（Raji細胞）株,在200r/min和400r/min（Namalva細胞）生長速度快,在80～1000r/min時既不結團,又不需要加抗泡沫劑,細胞生長仍然很快.各種細胞的適宜攪拌速度不一致,通常與細胞的特性和質量有關,應予以注意.